אלקטרופורזה

אלקטרופורזה היא שיטה בכימיה ובביולוגיה שמפרידה מולקולות בתערובת לפי גודל. השיטה עושה זאת על גבי ג'ל, חומר רך שמאפשר תנועה מבוקרת, בעזרת שדה חשמלי. צד אחד של הג'ל טעון חיובית והצד השני שלילית, והמולקולות הנטענות נעות אל הקוטב ההפוך. מולקולות קלות נודדות מהר יותר ומגיעות רחוק יותר בג'ל. גם הצורה המרחבית של מולקולות משפיעה על קצב התנועה, ולכן ההפרדה מתבססת לא רק על משקל אלא גם על צורה.

העיקרון דומה לכרומטוגרפיה, אך כאן הכוח המניע הוא חשמלי ולא כימי. אלקטרופורזה נפוצה במיוחד בביו-טכנולוגיה לגילוי והפרדת חלבונים וגדילי DNA ו-RNA.

בהפרדת חלבונים משתמשים בדרך-כלל בג'ל פוליאקרילאמיד. לפני ההרצה מוסיפים דטרגנט בשם SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). ה-SDS נקשר לחלבונים ומטעין אותם שלילית, ולכן רוב תנועת החלבונים בשדה החשמלי נובעת ממנו ולא מהמטען הטבעי של החלבון. ה-SDS גם מפרק את המבנה המרחבי של החלבון והופך אותו לקווי, כך שההפרדה מתבצעת לפי גודל בלבד. בנוסף משתמשים לפעמים בחומרים כמו DTT או יודואצטאמיד כדי לשבור או למנוע קשרים דיסולפידיים בין שיירי ציסטאין, וכך להשיג חלבונים בעלי צורה אחידה.
כדי לעקוב אחרי ההתקדמות מוסיפים צבע גלוי כמו קומאסי כחול, שמראה מתי להפסיק את הריצה.

להפרדת DNA ו-RNA משתמשים בג'ל אגרוז. כאן לא מוסיפים SDS. כדי לראות את חומצות הגרעין מוסיפים צבע פלואורסצנטי כמו אתידיום ברומיד, שמאיר תחת קרינת אולטרה-סגול. לדוגמה, מערבבים את הדגימות עם תערובת טעינה שמכילה מעט גליצרול, כדי שהדגימה תשקע בחריץ, וחומר צבע שמתקדם בקצב קבוע ומראה את מיקום הדגימות.
בגלל שהמבנה התלת־ממדי של חומצות הגרעין לא נהרס, ניתן לחתוך פסי DNA מהג'ל ולטהור אותם לשימושים נוספים.

כדי להעריך גדלים משתמשים בסולם, תערובת סטנדרטית של דגימות שגודלן ידוע. בסולמות DNA מקובל להשתמש בחתיכות שנוצרו על ידי חיתוך בידי אנזימי הגבלה. דוגמה מפורסמת היא חיתוך גנום פאג' למדא בעזרת אנזים HindIII, שיוצר תמיד סדרת פסים מוכרת (הפסים כוללים למשל 125 ו-564 נוקלאוטידים), ומשמשת להשוואה מול דגימות הנבדקות.

בשנת 1975 פותחה אלקטרופורזה דו-ממדית, שמחברת שני סוגי הפרדה: מיקוד איזואלקטרי (הפרדה לפי נקודת האיזואלקטריות, כלומר ה-pH שבו מטען החלבון הוא אפס) ובסיס אלקטרופורטי לאורך הציר השני. שיטה זו מפרידה חלבונים גם לפי נקודת האיזואלקטריות וגם לפי גודלם, ומאפשרת לזהות אלפי חלבונים על ג'ל אחד.

באלקטרופורזה בנים (Capillary) מתבצעת ההפרדה בצינור דק וארוך שמצופה בחומר כמו סיליקה. התערובת מוזרקת לצינור, והתוצאות נקראות על ידי גלאי ומוצגות גרפית. שיטה זו מהירה ומדויקת, אך דורשת ציוד יקר ומתקדם.

אלקטרופורזה היא דרך להפריד חלקיקים קטנים בעזרת חשמל. מחליפים נוזל בג'ל, חומר רך ודמוי ג'לי, ומעבירים זרם חשמלי. המולקולות עם מטען זזות אל הקוטב ההפוך. חלקיקים קלים זזים מהר יותר וחלקים כבדים זזים לאט.

לחלבונים שמוסיפים חומר בשם SDS שמקשר אליהם. ה-SDS עושה שהם הופכים לקווים ונדדים לפי גודל. לפעמים מוסיפים חומרים נוספים שעוזרים לשבור קשרים ולשמור על צורה אחידה. צבע כמו קומאסי כחול מראה מתי להפסיק.

ל-DNA ו-RNA משתמשים בג'ל אגרוז. מוסיפים צבע מיוחד שמאיר תחת אור אולטרה-סגול כדי לראות את ה-DNA. לפני הטעינה מערבבים תערובת שמעבירה את הדגימות לחריץ.
אפשר גם לחתוך פסים מהג'ל ולטהר את ה-DNA לשימוש נוסף.

כדי לדעת כמה גדול כל פס משתמשים ב"סולם". זהו שילוב של דגימות שגדלן ידוע. משווים את מיקום הפסים בדגימה אל מול הסולם.

יש גם אלקטרופורזה דו-ממדית שמפרידה לפי שני מדדים שונים. ישנה גם אלקטרופורזה בנים שמבצעת את הכל בצינור דק. השיטות האלה מהירות ומדויקות יותר, אבל יקרות.